永乐十一年，杭州。入夜后的香草院热闹非凡，死人的喊叫声音让那里顿时乱成一团，老鸨进屋查看发现客人死在床上，死者傅玉堂官至侍郎，是京城大官，老鸨急忙报官。杭州知府吴之问收到消息后派人赶往现场并封锁消息，香草院的老鸨和姑娘们被带走审问，老鸨否认杀人。
老鸨解释傅玉堂被杭州府的马车送去，打着吴府的灯笼，还拿出十两银子为证，吴之问陷入被动，他因牵扯案情而回避，案件交由洪通判审理。铁面御史周新无事在京城街上闲逛，看到饭馆有人闹事就出面调解，饭里的老鼠屎被揭穿，闹事之人被众人斥责，周新拂袖而去。纪纲岳父六十大寿，所邀人员如约而至，周新进门后从夫人手中看到一张纸条。
纸条上的内容让周新意外，他清楚朝廷要出大事，周新要找送信之人，他相信自己出现后对方会现身。周新猜出送信的人是思琪，思琪在野外现身，她说明傅玉堂之死，思琪劝周新不要多管，周新执意查案，思琪愿意追随左右，她从未考虑终身大事。
吴之问死在衙门，洪通判和推官余人杰发现后立即封锁府衙，但消息还是很快传出去。余人杰去找洪通判商量时被家丁拒绝，洪通判借故生病不见旁人。锦衣卫包围了吴之问的家，余人杰一时间不知如何是好，吴之问家中搜出大量金银财宝，吴府所有人员不得离开宅院。
铁面御史剧照
皇上召集从臣商量傅玉堂的死，众人议论纷纷，周新也是大惑不解。刑部和吏部对查案之事一再推托，皇上命周新去杭州查案，周新带圣旨前往，离行前岳父再三叮嘱，思琪又一次劝说，但周新坚持去杭州，思琪要陪他一同前往，她不能看着周新陷入险境。
铁面御史第2集剧情介绍周新在城门口遇上纪纲，纪纲提醒他此行要当心，周新和他道别后坐马车而去。思琪尾随周新去了杭州，周夫人在桌上看到她留下的信件。周新到杭州后查看吴之问和傅玉堂的遗体，洪通判仍躲藏在家中不敢出来，余人杰对周新的到来表示敬佩，周新清楚案件复
周新来到牢房，老鸨等人大喊冤枉，单独关押的梅春引起了周新的注意，当时傅玉堂就死在她的房间，周新询问梅春，他命人释放她并在外面安置清静的房间，老鸨等人也被放出。梅春在周新面前讲述她看到情况，她也曾感觉到奇怪的地方，梅春那晚离开房间一个多时辰，香草院的杂役值得怀疑，梅春否认和傅玉堂发生关系，周新让她呆在屋里不要乱跑。
周新在余人杰的陪同下来到洪通判家中，洪通判的房间乱成一团，他躲藏在床上装疯卖傻，周新准备上报京城让余人杰担任通判之职，当出门时收到梅春死亡的消息，老鸨等人消失。周新带人寻找送饭的伙计，张万和李顺赶马车追赶，周新进店发现可疑人之后追赶至一片树林，几名黑衣人围住他，思琪突然出现击退歹人。
思琪一直暗中保护周新，周新感觉事情蹊跷，他判断有人故意所为。纪纲建议把浙江按察使的人员归周新调用，皇上采纳，周新被封浙江按察使，余人杰代通判之职。周新给思琪定了几条规矩，他拒绝她当捕快，但可以帮忙处理案情。
周新收到京城消息，他和余人杰假设傅玉堂的行走路线，寻找跟班小扣子成为当务之急。知县穿着便装来到寺庙，他对斗蟋蟀很感兴趣。周新派了很多人寻找小扣子，思琪听到他的话，余人杰找思琪叙旧，她打算亲自出马寻找小扣子，思琪提醒他不要让周新知道。小扣子藏在斗蟋蟀的人群中，县令到时他慌忙跑开。思琪在寺庙打听到小扣子的行踪。
铁面御史第3集剧情介绍小扣子得知有人要找他时急忙离开，思琪继续沿线索追赶，小扣子故意躲避。秋香从寺庙回去途中被人调换篮子，等她发现多了一个铜镜后十分慌张，匆忙赶路时把脚扭伤。吴之问的夫人吴金自杀，周新和余人杰十分意外。秋香要过河时没赶上船，天色渐黑，无法回家让她担忧，突然出现的男人建议她留在仁和镇，她身上没带钱，那男人答应包她吃喝住，秋香跟他前往。
秋香陪那位男人在仁和镇的旅馆吃饭，思琪女扮男装也去了那家，小扣子出现在门口引起了思琪的注意，她追赶出去，但小扣子故意躲藏。思琪在仁和县衙门口看到知县回来，知县和众人在议论蟋蟀。
小扣子夜里溜入顺风旅馆，思琪见门开着进入住宿。秋香拿着铜镜仔细端详自己，她不明白有何特别之处，突然的敲门声让她有些害怕，来人是河旁遇到的男人，他已喝多。
秋香把门打开，那男人闯入，秋香到处躲藏，他要对她动粗，秋香解释肚子不舒服，她借机出门，那男人躺在床上睡着。小扣子暗中观察县令等人在斗蟋蟀，思琪没能找到他。秋香回房时看到那男人死在地上，她大声喊叫后从屋里跑出，床上的篮子被人翻动。
店老板听到声音后出门查看，店主向县衙禀报，县长闻讯而至。官府对死者验伤并分析案情，思琪在人群中查看，县令没有主意，师爷发现床上的香篮，那是女人所用，询问店主之后了解情况，县令怀疑死者被那女人所杀，师爷猜想可能是因奸情引发的血案，县令命人根据店主的描述画像，并通缉那个女人。
